Kromatografi Lapis Tipis

JUDUL PRCOBAAN
Kromatografi Lapis Tipis (Thin Layer Chromatografy, TLC)
TUJUAN PERCOBAAN
Pemisahan asam-asam amino dalam suatu campuran dengan cara kromatogarfi lapis tipis
LANDASAN TEORI
Pengertian kromatografi menyangkut metode pemisahan yang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fasa. Menurut pengertian ini kromatografi selalu melibatkan dua fasa yaitu fasa diam (stationary ophase) dan fasa gerak (mobil phase). Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu absorben), sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan disebut eluen atau pelarut, atau gas pembawa inert. Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan terjadinya migrasi diferensial komponen-komponen dalam sampel (Soebagio, 2002: 54).
Teknik ini bermanfaat sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase begerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada partikel-pertikel atau terserap didalam pori-pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau didalam pori (Khopkar, 2008: 52).
Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi dibandingkan dengan metode pemisahan lainnya ialah: (a) dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil (semi nikro dan mikro); (b) cukup selektif teruatama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen; (c) proses pemisahan dapat dilakukan dalam waktu yang relatif singkat; (d) seringkali murah dan sederhana, karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal dan rumit (Soebagio, 2002: 55).
Kromatografi lapisan tipis, atau TLC, seperti kromatografi kertas tidaklah mahal dan sederhana menjalankannya. Dibandingkan kromatografi kertas lebih cepat: proses itu mungkin memerlukan hanya sekitar setengah jam, sedangkan pemisahan yang lazim pada kertas memerlukan beberapa jam . TLC sangat populer dan secara rutin digunakan dalam banyak laboratorium. Medium pemisahannya berupa lapisan barangkali 0,1-0,3 mm zat padatan adsorben pada lempeng kaca, plastik atau aluminium. Lempeng yang lazim berukuran 20x5 cm (Underwood,1986: 153).
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan kepolaran. Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut (Wikipedia, 2011).
Teknik pengembangan dalam KLT sam dengan kromatografi kertas. Proses pengembangan umunya lebih cepat, memerlukan waktu 10 menit hingga 1 jam lebih. Pengembangan 5 menit dapat dilakukan secara sempurna dengan menggunakan kaca objek mikroskop sebagai papan KLT. Pemisahan pendahuluan dengan cara ini enak digunakan untuk menetukan kondisi optimum pengembangan. Cara ini untuk mengurangi terjadinya ekoran dengan hasil pemisahan yang lebih tajam. Penggunaannya terutama untuk ukuran sampel dengan rentanan 10-100 μg. Noda sampel akan mempunyai diameter 2-5 mm, jika digunakan larutan sampel 1-10μL dengan kadar 1%. Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan dengan kromatografi kertas, karena dapat digunakan teknik-teknik umum yang lebih banyak. Suatu teknik pendeteksian yang biasa dilakukan untuk senyawa organik adalahndengan penyomprotan dengan larutan H2SO4. Langkah ini kemudian diikuti dengan pemanasan untuk mengarahkan dan mengembangkan noda-noda hitam untuk keperluan analisa kuantitatif noda dapat dikerok, kemudian diekstraksi dengan pelarut polar tertentu. Kadar analit yang diinginkan diperiksa secara instrumen dari larutan hasil ekstraksi (Soebagio, 2002: 86-87).
Untuk maksud identifikasi, noda-noda sering dicirikan oleh Rfnya. Nilai Rf ialah perbandingan angka jarak berpindah zat terlarut itu dengan jarak berpindahnya garis depan pelarut dalam waktu yang sama. Nilai-nilai Rf yang identik untuk senyawa yang diketahui dan yang tidak diketahui, dengan menggunakan sistem-sistem pelarut yang berlainan, akan merupakan bukti yang cukup kuat bahwa keduanya identik, terutama jika mereka ddijalankan bersama-sama sepanjang satu pita kertas (Underwood, 1986: 152).
Sebagai contoh, jika suatun komponen berwarna merah bergerak 1,7 cm dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5,0 cm sehingga nilai Rf untuk komponen merah menjadi Rf=(1,7 cm)/(5,0 cm) = 0,34
Jika percobaan ini diulang pada kondisi yang tepat sama, nilai Rf yang diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainyya), nilai tersebut akan berubah (Clark, 2007).
Pada umunya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam tersebut perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi lapis tipis, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan diatas absorben dan dibiarkan bergerak. Pemisahan asam amino didasarkan perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu (Poedjiadi, 2009: 100-101).
Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah visualisasi. Tahap ini sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang diuji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol (Wikipedia, 2011).
Ninhidrin adalah senyawa organik dengan rumus kimia C9H6O4. Padatan kristalnya berwarna putih, larut dalam air dan alkohol. Digunakan sebagai pereaksi untuk uji adanya gugus amino bebas dan karboksilat dalam protein dengan memberikan warna biru. Mengurai pada 214-243oC. Strukturnya sebagai berikut:

(Mulyono, 2005: 294).

ALAT DAN BAHAN
Alat
Gelas Kimia
Gelas ukur
Penggaris
Gunting
Pensil
Pipa kapiler
Pipet tetes
Bahan
Ninhidrin 0,3% (dalam butanol yang mengandung 3% asam asetat glasial)
Larutan pengelusi A (butanol:asam amino:air = 80:20:20)
Larutan pengelusi B (propanol:air = 70:30 v/v)
Larutan asam amino standar (alanin, asam glutamat, asam aspartat, histidin, dan tyrosin)
Asam amino X
Plat KLT
Aluminium foil
Tisue
Aquades
PROSEDUR KERJA
Menyiapkan larutan pengelusi A dengan mencampurkan 40 ml n-butanol dengan 10 mL asam asetat glasial dan 10 mL aquades
Menyiapkan larutan pengelusi B dengan mencampurkan 35 mL propanol dengan 15 mL aquades
Menyiapkan larutan asam-asam amino standar
Menotolkan 2 tetes asam-asam amino dan asam amino X pada 2 plat KLT yang berbeda. Membiarkan totolan pertama mengering kemudian menotolkan totolan kedua
Membiarkan totolan kering kemudian memasukkan masing-masing plat ke dalam pengelusi A dan pengelusi B (± 0,5 cm bagian bawah lempeng tercelup)
Mengangkat plat setelah larutan pengelusi merambat hingga batas rambat pada plat
Mengeringkan plat dan menyemprotkan dengan larutan ninhidrin pada permukaan plat
Membiarkan beberapa menit, jika tidak timbul noda (warna) maka memanaskan plat sampai timbul warna
Menghitung harga Rf dari asam-asam amino dan asam amino X yang diamati
HASIL PENGAMATAN
Larutan pengelusi A
40 mL n-butanol (bening) + 10 mL CH3COOH (bening) + 10 mL H2O (bening) → larutan pengelusi A
Larutan pengelusi B
35 mL propanol (bening) + 15 mL H2O (bening) → larutan pengelusi B
Plat KLT □(→┴ditotolakan ) asam-asam amino (alanin, asam glutamat, asam aspartat, histidin, tyrosin dan campuran X ) → dicelup dalam larutan pengelusi A dan B → dikeringkan □(→┴(disemprotkan ) ) ninhidrin → oven → noda ungu dan coklat.


Komponen
Nama Asam Amino Harga Rf
Pengelusi A Pengelusi B
j
Standar


Alanin (0,7 cm)/(3,5 cm) = 0,20 (1,1 cm )/(3,7 cm) =0,30
Asam Glutamat (0,65 cm)/(3,6 cm) = 0,18 (1,1 cm )/(3,8 cm) = 0,29
Asam Aspartat (0,6 cm)/(3,5 cm) = 0,17 (1,2 cm)/(3,7 cm) =0,32
Histidin (0,5 cm )/(3,65 cm) = 0,14 (0,6 cm)/(3,8 cm) =0,16
Tyrosin (1,2 cm)/(3,7 cm) = 0,32 (1,6 cm)/(3,8 cm) =0,43
Campuran Sampel X (0,65 cm )/(3,7 cm) = 0,18 (1,6 cm)/(3,85 cm) = 0,42

ANALISIS DATA
Pengelusi A
Alanin d. Histidin
Dik: Jarak noda= 0,7 cm Dik: Jarak noda= 0,5 cm
Jarak eluen = 3,5 cm Jarak eluen = 3,65 cm
Dit: Rf=.....? Dit: Rf=.....?
Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen ) Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen )
=(0,7 cm)/(3,5 cm) = 0,20 =(0,5 cm)/(3,65 cm) = 0,14
Asam glutamat e. Tyrosin
Dik: Jarak noda= 0,65 cm Dik: Jarak noda= 1,2 cm
Jarak eluen = 3,6 cm Jarak eluen = 3,7 cm
Dit: Rf=.....? Dit: Rf=.....?
Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen ) Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen )
=(0,65 cm)/(3,6 cm) = 0,20 =(1,2 cm)/(3,7 cm) = 0,32
Asam aspartat f. Sampel X
Dik: Jarak noda= 0,6 cm Dik: Jarak noda= 0,65 cm
Jarak eluen = 3,55 cm Jarak eluen = 3,7 cm
Dit: Rf=.....? Dit: Rf=.....?
Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen ) Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen )
= (0,6 cm)/(3,55 cm) = 0,17 =(0,65 cm)/(3,7 cm) = 0,18
Pengelusi B
Alanin d. Histidin
Dik: Jarak noda= 0,6 cm Dik: Jarak noda= 0,60 cm
Jarak eluen = 3,55 cm Jarak eluen = 3,80 cm
Dit: Rf=.....? Dit: Rf=.....?
Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen ) Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen )
= (1,1 cm)/(3,70 cm) = 0,30 =(0,60 cm)/(3,80 cm) = 0,36
Asam glutamat e. Tyrosin
Dik: Jarak noda= 1,1 cm Dik: Jarak noda= 1,6 cm
Jarak eluen = 3,70 cm Jarak eluen = 3,80 cm
Dit: Rf=.....? Dit: Rf=.....?
Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen ) Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen )
= (1,1 cm)/(3,80 cm) = 0,29 =(1,6 cm)/(3,80 cm) = 0,43
Asam aspartat f. Sampel X
Dik: Jarak noda= 1,2 cm Dik: Jarak noda= 1,6 cm
Jarak eluen = 3,7 cm Jarak eluen = 3,85 cm
Dit: Rf=.....? Dit: Rf=.....?
Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen ) Peny: Rf= ( Jarak noda)/(Jarak eluen )
= (1,2 cm)/(3,70 cm) = 0,32 =(1,60 cm)/(3,85 cm) = 0,42

PEMBAHASAN
Percobaan ini bertujuan untuk memisahkan asam-asam amino dalam suatu campuran dengan cara kromatogarfi lapis tipis. Langkah pertam yang dilkukan adalah membuat larutan pengelusi A dan B. Larutan pengelusi A dibuat dengan mencampurakan n-butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 80;20:20. Larutan pengelusi B dibuat dengan mencampurkan propanol dan air dengan perbandingan volume 70:30. Selanjutnya menyiapkan plat KLT sebanyak 2 lempeng. Plat pertama untuk pengelusi A dan plat kedua untuk pengelusi B. Masing-masing plat ditotolkan asam-asam amino (alanin, asam glutamat, asam aspartat, histidin dan tyrosin) dan sampel X. Masing-masing totolan berjarak 1 cm dengan totolan yang lain. Fungsinya agar noda tiap totolan tidak bercampur. Jarak totolan dari bawah plat 1 cm. Setiap plat ditotol sebanyak 2 kali untuk masing-masing senyawa. Totolan kedua diberikan setelah totolan pertama sudah kering. Setelah kering, plat kemudian dimasukkan dalam masing-masing larutan pengelusi yang sebelumnya telah dibuat dan dijenuhkan. Cara menjenuhkan larutan pengelusi adalah dengan menutup wadah pengelusi dan tidak menggoyangkannya (didiamkan). Fungsi menutup wadah (gelas kimia) adalah meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap pelarut.
Setelah kedua plat dimasukkan dalam masing-masing pengelusi, wadah kembali ditutup kembali dan mengamati pergerakan pelarut. Jika pergerakan pelarut tiba pada batas atas dari plat, maka palt diangkat dan dikeringkan kemudian disemprotkan dengan larutan ninhidrin yang berfungsi untuk memberikan warna noda karena ninhidrin merupakan pendeteksi adanya gugus amina bebas dari asam amino. Karena noda yang terbentuk setelah penyemprotan ninhidrin kurang jelas sehingga kedua plat dipanaskan dalam oven, dan muncullah warna ungu dan cokelat. Menurut teori, apabila sampel mengandung gugus amino maka ninhidrin akan bereaksi menjadi warna ungu. Dari hasil pengamatan dan analisis data diperoleh Rf masing-masing senyawa pada larutan pengelusi A dan B. Pada pengelusi A, Rf alanin, asam glutamat, asam aspartat, histidin, tyrosin dan sampel X berturut-turut 0,2; 1,8; 0,17; 0,14; 0,32 dan 0,18. Berdasarkan nilai Rf tersebut, maka sampel X adalah asam glutamat karena memiliki nilai Rf yang sama pada pelarut yang sama. Pada pengelusi B, nilai Rf untuk analin, asam glutamat, asam aspartat, histidin, tyrosin dan sampel X berturut-turut adalah 0,30; 0,29; 0,32; 0,16; 0,43 dan 0,42. Dari nilai Rf ini dapat dilhat bahwa sampel X adalah Tyrosin, karena memiliki nilai Rf yang sama pada pelarut yang sama. Nilai Rf sampel berbeda pada masing-masing pengelusi karena menurut teori, jika pada kondisi yang sama nilai rf yang diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama, namun jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah. Dalam percobaan ini komposisi pelarut (larutan pengelusi) A dan B berbeda. Pengelusi A adalah n-butanol, asam asetat glasial, dan air sedangkan pengelusi B adalah propanol dan air. Sehingga nilai Rf untuk masing-masing sampel berbeda. Adapun reaksi antara asam-asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut:
Alanin + ninhidrin

Asam Glutamat + Ninhidrin




Asam Aspartat + Ninhidrin

Histidin + Ninhidrin

5. Tyrosin + Ninhidrin

KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Rf untuk asam-asam amino pada pengelusi A yaitu alanin= 0,20, asam glutamat = 0,18, asam aspartat= 0,17, histidin= 0,14, tyrosin= 0,32 dan sampel X= 0,18.
Rf untuk asam-asam amino pada pengelusi A yaitu alanin= 0,30, asam glutamat = 0,29, asam aspartat= 0,32, histidin= 0,16, tyrosin= 0,43 dan sampel X= 0,42.
Sampel X mengandung asam glutamat dan tyrosin.
Saran
Diharapkan agar prktikan memperhatikan posisi plat dalam masing-masing pengelusi, jangan sampai tercelup dalam larutan pengelusi.


DAFTAR PUSTAKA


Clark, Jim. 2007. Kromatogrfi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/ instrumen_analisis/kromatigrafi1/kromatografi_lapis_tipis/. Diakses tanggal 27 Mei 2011.

Khopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta. UI-Press.

Mulyono, HAM. 2005. Kamus Kimia. Bandung. Buni Aksara.

Poedjiadi, Anna. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta. UI-Press.

Soebagio. 2002. Kimia Analitik II. Malang. Universitas Negeri Malang.

Underwood. 1986. Analisis Kimia Kualitatif. Jakarta. Erlangga.

Wikipedia. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. http://id.wikipedia.org/wiki/kromatografi _Lapis_Tipis#cite_note-sko-0. Diakses tanggal 27 Mei 2011.













JAWABAN PERTANYAAN

Jika protein dihidrolisis oleh asam kuat maka akan terurai menjadi asam-asam amino penyusunnya.
Prinsip dasar KLT yaitu sama dengan kromatografi kertas yang terdiri atas fasa diam berupa lapisan tipis dan suatu absorbaan penyangga yang halus diatas suatu lempeng gelas atau aluminium, dan fasa geraknya berupa pelarut tertentu
3. Nama asam amino yang telah diidentifikasi berdasarkan harga Rfnya yaitu tyrosin dan asam aspartat.